1 引言

現(xiàn)代細(xì)胞計(jì)數(shù)儀采用自動(dòng)化方法對(duì)特定濃度范圍內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。高濃度的上限受限于準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞邊界的能力，而低濃度的下限則由攝像頭視場(chǎng)（FOV）等因素決定。然而，當(dāng)圖像中只有少量可辨別的細(xì)胞或特征時(shí)，自動(dòng)聚焦失敗可能會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)性能，導(dǎo)致較高的變異系數(shù)（CV）。在細(xì)胞濃度足夠的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，這通常是一個(gè)次要問(wèn)題，但在如細(xì)胞治療產(chǎn)品制造初期種子培養(yǎng)階段的極低濃度樣本中，這一問(wèn)題則顯得尤為關(guān)鍵。在此類(lèi)情況下，獲得清晰圖像對(duì)于實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確細(xì)胞計(jì)數(shù)至關(guān)重要。為了解決這一問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)了一種新型自動(dòng)聚焦算法，通過(guò)先進(jìn)技術(shù)精確識(shí)別圖像特征。本技術(shù)說(shuō)明討論了LUNA-FX7™軟件（1.9.1及以上版本）中針對(duì)極低濃度優(yōu)化的最新更新，同時(shí)展示了LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的性能。

2 LUNA-FX7™的自動(dòng)聚焦過(guò)程

LUNA-FX7™系統(tǒng)采用基于圖像對(duì)比度的自動(dòng)聚焦算法。該自動(dòng)聚焦過(guò)程由粗略掃描和精細(xì)掃描組成，確保LUNA-FX7™系統(tǒng)的最佳聚焦性能（圖1）。其首先通過(guò)粗略掃描在廣泛的Z平面范圍內(nèi)采集圖像，以覆蓋較大的景深。在此過(guò)程中，算法確定一個(gè)大致的焦平面。隨后，進(jìn)行精細(xì)掃描，專(zhuān)注于更窄的Z平面范圍，精確確定最佳焦平面。此過(guò)程基于圖像特征，保證了LUNA-FX7™系統(tǒng)的最佳聚焦性能。

圖1. 圖示LUNA-FX7™系統(tǒng)自動(dòng)聚焦過(guò)程的工作流程，包括粗略掃描和精細(xì)掃描

自動(dòng)聚焦的挑戰(zhàn)

依賴圖像對(duì)比度的自動(dòng)聚焦算法在僅有少量目標(biāo)物體或特征較少的情況下，可能難以準(zhǔn)確確定適合的聚焦位置。在粗略掃描階段，這一問(wèn)題尤為明顯，系統(tǒng)可能難以識(shí)別合適的Z平面，導(dǎo)致后續(xù)精細(xì)掃描中聚焦失敗（圖2A）。為了解決這些挑戰(zhàn)，我們開(kāi)發(fā)了一種新算法，以增強(qiáng)在低細(xì)胞濃度或圖像特征有限條件下的目標(biāo)物體識(shí)別能力（圖2B）。該改進(jìn)算法提高了自動(dòng)聚焦過(guò)程的精確性和可靠性，在復(fù)雜場(chǎng)景中提供更精確和一致的結(jié)果。

圖2. 不同算法在聚焦中的表現(xiàn)。(A) 算法1未能找到焦點(diǎn)，導(dǎo)致圖像模糊不清 (B) 算法2成功識(shí)別合適的聚焦位置，圖像清晰銳利

改進(jìn)的自動(dòng)聚焦性能

為驗(yàn)證新開(kāi)發(fā)的自動(dòng)聚焦算法的有效性，我們通過(guò)使用相同樣本對(duì)LUNA-FX7™系統(tǒng)的不同軟件版本進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)，新自動(dòng)聚焦算法的性能有顯著提升。這一顯著改進(jìn)通過(guò)采用組合方法增強(qiáng)了目標(biāo)檢測(cè)的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了所有視場(chǎng)中更精確和可靠的聚焦位置（圖3）。即使在每張圖像中目標(biāo)物體少于五個(gè)的極低細(xì)胞濃度下，升級(jí)后的算法仍能實(shí)現(xiàn)精確的聚焦位置，表現(xiàn)出一致的準(zhǔn)確性。

圖3. 將U937細(xì)胞稀釋至2.54 x 10?細(xì)胞/mL的濃度，使每張圖像中目標(biāo)物體少于5個(gè)。顯示完整的12個(gè)視場(chǎng)。算法2能有效檢測(cè)和識(shí)別目標(biāo)物體(A)，而算法1未能實(shí)現(xiàn)理想聚焦(B)

結(jié)論

LUNA-FX7™系統(tǒng)在極低細(xì)胞濃度下提供了準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)采用增強(qiáng)目標(biāo)檢測(cè)靈敏度的組合方法，我們改進(jìn)的自動(dòng)聚焦算法顯著提升了性能。在目標(biāo)物體或特征有限的情況下，該算法能夠準(zhǔn)確識(shí)別聚焦位置。這些改進(jìn)使LUNA-FX7™系統(tǒng)在復(fù)雜條件下成為可靠且高效的細(xì)胞計(jì)數(shù)解決方案。新型自動(dòng)聚焦算法已應(yīng)用于LUNA-FX7™ 1.9.1版本及以上的軟件中。