利用腸道芯片和4D成像了解病原體入侵

1 摘要

1.1 實時機械生物學研究挑戰

在病原體與人體之間復雜的相互作用過程中，機械信號發揮著重要作用，它決定著基因表達、黏附動力學，甚至形態發生。從細胞外基質的密度、泌尿道中流體流動的剪切力，到血管的迂曲程度，機械生物學領域與基礎生物學過程緊密交織。然而，要實時捕捉這些動態變化，尤其是在像腸道這樣復雜的微環境中，一直是一個難題，因為共聚焦顯微鏡的成像速度太慢，無法對腸道蠕動進行成像 [1] 。

1.2 腸道芯片模型

器官芯片（OoC）技術的發展為研究機械生物學事件開辟了新的契機。該技術所構建的微型生態系統能夠以較高的保真度模擬生理條件，尤其適用于研究那些僅在人類中出現且無法在動物模型中復制的病癥。通過整合多種細胞類型以及有助于維持體內平衡條件的多孔膜，器官芯片平臺在引入諸如流體流動和蠕動等關鍵要素的同時，還能模擬器官的微觀結構。但要獲得全面的研究見解仍面臨諸多障礙，尤其是在實現實時三維成像以及研究瞬時事件方面。

該研究涉及兩種病原體的入侵機制：

1.2.1 溶組織阿米巴變形蟲（導致阿米巴病）

阿米巴病是由溶組織阿米巴變形蟲引起的，溶組織阿米巴變形蟲是一種專門攻擊人類的寄生蟲。雖然許多感染沒有癥狀，但一旦寄生蟲突破腸道內壁，就會引發疼痛性腹瀉，并伴有出血和潰瘍形成。更嚴重的話，阿米巴病可能會升級為肝臟、肺和腦等重要器官膿腫的形成。

圖1 溶組織內阿米巴（紅色輪廓）正在破壞人類結腸的粘液層

1.2.2 志賀氏菌（導致志賀氏菌病的細菌）

志賀菌病由志賀菌感染引起，志賀菌是大腸桿菌的不同變種。這些細菌攜帶著一種毒力質粒，使其能夠僅侵入人類腸道上皮細胞，隨后侵入黏膜層。這種入侵會引發嚴重的炎癥，并伴隨著廣泛的組織損傷。

圖2 志賀菌侵入人類腸道上皮細胞

2 研究目的

這項工作目的是在周期性變形條件下對芯片器官進行四維實時成像，模擬腸道的蠕動運動。除了實現可視化之外，這種方法還能揭示組織的流變學特性，為深入了解機械應力的時空分布提供了新的視角。該研究以腸道屏障為重點，展現了機械信號與病原體侵襲之間的相互作用，突出了溶組織內阿米巴和志賀氏菌的致病機制。

研究觀察了多種參數：宿主細胞的死亡情況、組織的連接性、病原體的追蹤、入侵及定殖情況，以及應力相關性。

3 實驗設置

3.1 材料

l 腸道芯片

l T2i 旋轉盤共聚焦顯微鏡

l ORCA-Flash 4.0 數字 CMOS 相機

l OB1 MK3+ 流量控制器

l MSF 流量傳感器

l Elveflow 軟件界面

圖3 從細胞培養到數據分析的端到端工作流程示意圖

3.2 4D實時成像優化

首先，在蠕動條件下獲取視頻面臨多項挑戰，本研究已解決：

l 對齊問題：視頻序列通常與周期性蠕動運動不同步。為了解決這個問題，有必要將其對齊到一個四維數據堆棧中，同時要考慮到周期之間的時間延遲。

l 組織曲率：組織的曲率可能導致圖像失焦，這就需要進行二維投影處理。

l 運動校正：可能發生平面外運動，需要運動校正技術來確保成像準確。

3.3 腸道芯片感染實驗
腸道芯片包含兩個腔室。上腔室灌注有培養基，并培養著Caco2細胞，而下腔室則專門用于灌注培養基。一塊橫向的膜能夠進行機械拉伸，以模擬腸道的蠕動運動。隨后通過向該系統中注入受感染的培養物，從而實現了細菌和類變形蟲的感染。

3.4 微流體蠕動應力設置
該微流控裝置通過點成Elveflow的 ESI 軟件進行監控，并使用 OB1壓力控制器在三通道設置下進行監測（見圖 4）：

l 通道 1：向腸道芯片的頂部通道灌注培養基，該通道內含有Caco2細胞（源自人類結腸的上皮細胞）。連接MFS流量傳感器（流速為每小時30微升）。

l 通道 2：向腸道芯片的底部通道灌注培養基。連接MFS流量傳感器（流速為每小時30微升）。

l 通道 3：進行側向真空拉伸操作，以模擬結腸的蠕動（幅度為10%，頻率為0.15Hz）。

圖4 點成Elveflow 微流體裝置采用芯片模擬腸道，以重現蠕動運動

4 主要發現

實驗控制參數說明：WP：存在類似蠕動的拉伸；WOP：不存在類似蠕動的拉伸；福氏志賀菌 - mxiD：無毒菌株；TSAR 福氏志賀菌菌株在三型分泌系統（T3SS）激活時會表達綠色熒光蛋白（GFP）（這是毒力基因誘導的標志物，可使細菌侵入宿主細胞）；半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）可抑制變形蟲對細胞膜的降解作用。

4.1 組織流變學模型的建立

為了比較局部應力和局部毒力，建立了一個組織流變學研究模型。然而，芯片的封裝結構使得無法使用流變學探針，并且與壓力泵指令相比，聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架會改變機械性能。因此，基于視頻分析開發了一個可靠的數學模型來應對這些挑戰。

4.2 福氏志賀氏菌的動態入侵過程

為了研究福氏志賀菌的感染動態，研究人員在感染后的 1 至 2 小時內持續進行監測，并將結果與無毒菌株（福氏志賀菌 - mxiD）進行對比。他們觀察了兩個關鍵參數：細菌菌落的擴展程度以及單個細菌侵入所需的時間。

4.2.1蠕動促進細菌定殖，使其更早開始且擴展更迅速

事實上，隨著蠕動運動的發生，細菌數量顯著增加（圖 5A）。此外，在感染后的最初 2 小時內，TSAR（三型分泌系統激活相關指標）的激活經歷了兩個不同階段，這表明在有蠕動的情況下，毒力基因會更早且更廣泛地被誘導激活（圖 5B）。

圖5 福氏志賀氏菌的組織入侵 

A) 生長菌落中的細菌數量 (N=8)，B) 作為其分泌系統標記的 TSAR 激活細菌數量示例曲線 (N=4)

4.2.2 局部機械應力加速細菌在細胞間的傳播

研究人員通過比較單個細菌中 TSAR 的激活速度，來探究局部機械應力對福氏志賀菌的影響。為了實現這一目的，利用藍色膜探針 Pro12A 計算出組織的應力圖譜，并將其與單個細菌的 TSAR 激活情況進行對比。如圖 6 所示，研究人員觀察到，在上皮應力較高的區域，細菌的激活時間明顯更早。

圖6 疊加了 TSAR 激活時間的應力圖（一個周期的平均值）；

每個點對應于跟蹤激活的 (x, y) 坐標（越暗，激活時間越快）

4.3 溶組織內阿米巴原蟲的動態侵襲過程

在對溶組織內阿米巴的感染研究中，研究人員采用了嚴格的 7 小時監測期，以 30 分鐘或 1 小時為間隔進行觀察，并與使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）來防止細胞降解的對照組進行對比。研究人員觀察了三個關鍵參數：細胞死亡情況、組織連接性以及病原體的侵入情況。

4.3.1 蠕動促進類變形蟲對組織的降解和侵襲

通過熒光顯微鏡分析發現，與靜態組織（無蠕動，即 WOP）相比，在類變形蟲感染 3 小時后，有蠕動（WP）的情況下細胞死亡率增加了 10%（圖 7A）。為了研究組織損傷情況，研究人員還觀察了細胞的連接性，結果顯示在受到感染后約 3 至 4 小時出現了連接失效的情況（圖 7B）。

圖7 變形蟲感染后在蠕動條件下的組織降解

A) 死細胞占總死細胞的百分比(N=8)。基于E-鈣粘蛋白連接的組織連接性評估(N=6)

組織降解的過程也通過熒光顯微鏡進行了觀察（圖 8）。簡而言之，在感染過程中，溶組織內阿米巴（紅色）降解了刷狀緣上的肌動蛋白（紫色），吞噬了死亡細胞（黃色），并切斷了 E - 鈣黏蛋白（綠色）連接。本研究闡明，蠕動運動積極地促進了這一過程，突顯了感染機制與組織力學之間的緊密聯系。

圖8 類變形蟲感染后1小時和3小時的組織降解及侵襲過程。

紅色：變形蟲；紫色：肌動蛋白；綠色：E-鈣黏蛋白；黃色：死亡細胞（比例尺為20微米）。

溶組織內阿米巴分泌的半胱氨酸蛋白酶對于高效降解和侵入人體結腸組織至關重要。在使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）的芯片實驗條件下，無論是有蠕動（WP）還是無蠕動（WOP）的情況，都未再觀察到組織降解和寄生蟲侵入的現象（圖 9）。這凸顯了半胱氨酸蛋白酶活性在有效分解和侵入組織過程中的關鍵作用，同時也驗證了芯片上器官（OoC）是研究阿米巴病初始階段的一個準確模型。

圖9 變形蟲感染7小時后的共聚焦z軸層疊圖像。

左側為未使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑的情況，右側為使用了半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）的情況，

上方為存在蠕動運動的情況，下方為不存在蠕動運動的情況。

4.3.2 局部機械應力增強類變形蟲的入侵能力

最終研究確定，與沒有蠕動的情況相比，蠕動會減少變形蟲在上皮組織上的遷移，從而有助于其侵入組織。通過使用與分析局部應力相同的關聯方法，將單個變形蟲的侵入速度與局部應力水平進行比較后發現，從統計學角度來看，在由蠕動運動引發的較高應力區域，寄生蟲侵入成功的概率更高。

5 結論

蠕動在腸道組織更新過程中發揮著作用，它能促使上皮細胞和微生物群脫落。抑制胃腸蠕動通常會導致細菌過度生長，這表明蠕動運動對于降低感染風險從根本上來說至關重要。然而，研究結果表明，盡管福氏志賀菌和溶組織內阿米巴在大小、生命周期和感染機制上存在顯著差異，但蠕動運動卻是這兩種病原體侵入的決定性因素。這些病原體已經進化到能夠利用結腸環境信號，這意味著我們需要重新審視在靶器官生態位中研究宿主與病原體相互作用的方式。蠕動運動和局部機械應力對這兩種病原體感染的影響概述如圖 10 所示。

圖10 蠕動運動和局部機械應力對福氏志賀菌和溶組織內阿米巴侵襲策略的影響。

使用Biorender軟件繪制。

引用
[1] A. Boquet-Pujadas et al., “4D live imaging and computational modeling of a functional gut-on-a-chip evaluate how peristalsis facilitates enteric pathogen invasion," 2022. [Online]. 

[2] A. Grassart et al., “Bioengineered Human Organ-on-Chip Reveals Intestinal Microenvironment and Mechanical Forces Impacting Shigella Infection," Cell Host Microbe, vol. 26, no. 3, pp. 435-444.e4, Sep. 2019, doi: 10.1016/j.chom.2019.08.007.